硫酸阿米卡星EP杂质简介

本文是一个连续剧，前情提要请参考《2024年第12期 | 氨基糖苷类抗生素-阿米卡星杂质(Amikacin Impurities)稳定性研究分享》和《24V13 | 破解「阿米卡星未知杂质」之谜，文末福利欢迎参与！》

硫酸阿米卡星（Amikacin sulfate）是一种半合成的氨基糖苷类抗生素，主要用于治疗由革兰氏阴性菌引起的严重感染。阿米卡星是从卡那霉素A（Kanamycin A）化学衍生而来，其化学名称是6-O-(3-Amino-3-deoxy-α-D-glucopyranosyl)-4-O-(6-amino-6-deoxy-α-D-glucopyranosyl)-1-N—[(2S)-4-amino-2-hydroxybutanoyl]-2-deoxy-D-streptamine sulfate。

阿米卡星的合成过程如下：

1. 起始物质: 卡那霉素A(Kanamycin A)。

2. 化学修饰:

o N-酰化反应: 将卡那霉素A的氨基进行N-酰化反应。

o L-HABA修饰: 使用L-(-)-γ-氨基-α-羟基丁酸(英文：(2S)-4-amino-2-hydroxybutanoyl, 缩写：L-HABA)对暴露的1位氨基进行选择性酰化反应

o 脱乙酰化反应: 接着进行选择性脱乙酰化反应，得到阿米卡星。

3. 硫酸盐化: 最后，将阿米卡星转化为硫酸盐形式，以提高其溶解性和稳定性。

在阿米卡星的化学合成中涉及到官能团的选择性问题，以及起始试剂杂质干扰的问题。因此在欧洲药典(EP)收录的硫酸阿米卡星杂质中多为多酰基化杂质、酰基区域选择性杂质或起始物料引入的杂质。(可前往官网www.qcsrm.com查看阿米卡星所有24个杂质结构)

例如杂质A是L-HABA酰基化在3位氨基的杂质；杂质B是L-HABA在1,3位氨基双酰基化杂质；杂质C是L-HABA酰基化在3’位氨基酰基化的杂质；杂质D是残留的起始物料卡那霉素A(Kanamycin A)；杂质E是L-HABA酰基化在6’位氨基酰基化的杂质；杂质F是L-HABA在1, 6’位氨基双酰基化杂质；杂质G是异构体D-HABA酰基化在1位氨基的杂质；杂质H是2’位羟基转化为氨基的杂质；杂质I是是残留的起始物料L-HABA。

以下是欧洲药典参考色谱图：

欧洲药典杂质B、G的问题

阿米卡星硫酸盐想必有很多医药企业在进行研究，而欧洲药典所收录的以上杂质必然是研究的重中之重。但是，QCS标准物质研发中心在对阿米卡星杂质B和G进行研究的过程中发现欧洲药典对以上两个峰的归属可能存在错误，其色谱图(图3)结果中峰3标记为杂质B，峰5标记为杂质G。然而我中心已经收到多个客户反馈，杂质B和G欧洲药典色谱结果与实际检测结果相反。

为了验证客户反馈结果并解决客户研究中的定位问题，我中心研究人员对两个杂质分别进行了定向合成，并经过液相、质谱、核磁共振氢碳谱以及COSY、HSQC、HMBC、NOESY等二维核磁共振技术对所合成标准样品进行了鉴定，确认我中心杂质B、G结构无误。通过液相条件下的对比验证，我们认为欧洲药典在对阿米卡星杂质B和G的归属发生了错位，两个目标峰归属应该调换。

QCS标准物质研发中心对阿米卡星硫酸盐、阿米卡星杂质B、阿米卡星杂质G液相色谱结果图如下所示：

本次研究中使用的杂质标准样均经过了充分表征。

杂质B和杂质G表征结果如下

阿米卡星EP杂质B(RM-A131102;CAS: 927821-99-6; Amikacin EP Impurity B)测试数据含HPLC,MS,HNMR,COSY、HSQC、HMBC、NOESY。

图5：阿米卡星硫酸盐杂质B测试数据

阿米卡星EP杂质G(RM-A131107;CAS:50896-99-6;Amikacin EP Impurity G)测试数据含HPLC,MS,HNMR,COSY、HSQC、HMBC、NOESY。

图6：阿米卡星硫酸盐杂质G测试数据

总结

由于阿米卡星EP杂质B和G具有不同的分子结构，通过质谱可以对以上两个产品进行很好的区分。同时结合氢谱、碳谱以及二维核磁相关证据证明其结构无误，QCS标准物质研发中心使用鉴定后的标样对欧洲药典所记载的液相结果进行了复现。以阿米卡星硫酸盐原料药为对照，在液相结果中可以很明显地观察到杂质G先于原料药被洗脱，而杂质B晚于原料药被洗脱。因此我们认为欧洲药典所收录的杂质B和G的液相色谱峰归属可能需要互换，提醒各位相关研究人员注意以上问题。同时，针对该问题我中心已经同步向欧洲药典（EDQM）相关部门进行了数据反馈，后续进展我们将持续更新。