从利伐沙班二胺三胺杂质

确定浅析进口代码杂质结构推导思路

开大会，忆十年。不得不谈谈这十年之中仿制药研发的“爆款”——利伐沙班原料及片剂（商品名：拜瑞妥）。受邱总邀请，公众号上码码字，略陈己见，只为回忆。

图1：合成路线

Chapter 1

2012-2013年的时候，本人有幸负责公司利伐沙班项目的开发，但在那个“抢前三”的年代，项目的启动已经落后其他公司快一年了。利伐沙班片的进口注册质量标准已经拿到手了，合成路线也早已打通了，可标准上几个特殊代号的杂质成了亟待解决的难题。这几个杂质按照标准上的检测方法有确定的相对保留时间，自制样品里有这些杂质，液相上能够定位检测到。这几个杂质的翻译有趣的很，什么乙酰草酰胺、二-草酰胺-尿素，脱氯、氧代邻苯二甲酰亚胺，二氯、二胺、三胺等，没有具体的化学结构式，但多少包含一些信息。

一番头脑风暴下来，文献+潜在杂质的推测和合成完毕。通过自制API样品的检测，有四个杂质根据相对保留时间及引入的可能性被确定了出来，只剩下了最后的3个杂质：乙酰草酰胺、二胺和三胺。接下来逐一分析，各个击破。

乙酰草酰胺中的乙酰基从何而来？先不管原因，按照之前几个杂质的成功推定的思路，把中间体2和乙酰基接上，相对保留时间看看能不能对上。结果真的就对上了。

图2：中间体2和乙酰草酰胺杂质结构信息

二胺和三胺的名字听上去像是二聚体或者三聚体，并且出峰时间也较晚，确实是有这种可能性存在。通过自制API检测发现，样品里面并不含有这2个杂质。

当时杂质研究和工艺开发都是我自己一个人在做，由于二胺和三胺暂时也想不出来怎么产生的，只好开始小试工艺优化及放大，看看工艺完全确定后产品中杂质谱到底是个什么情况。与此同时一些来推销利伐沙班工艺的客户捆绑了杂质前来游说；网上论坛也有人在讨论这2个杂质，说是一个英国回来的博士正在推测这个杂质；还有一个高校的教师闭门造车，在得知相对保留时间不是的情况下，死鸭子嘴硬非要把一个杂质B说成是二胺……

图3：网传二胺结构信息

Chapter 2

小试工艺开发的过程中我发现，利伐沙班API的溶解性很差，重结晶及溶解过滤能选的溶剂也就DMSO等几种，没有一个特别好的方案。同时利伐沙班片剂的研发也在紧锣密鼓的进行着，一份关于原研制剂方面的半公开资料中的利伐沙班原料COA引起了我的极大的关注：有关物质只有3种，乙酰草酰胺、二胺和三胺，仍然没有结构信息！但是，溶残检测中出现了醋酸！

回忆起那段时间，我简直比卓伟还卓伟，不放过任何一条信息。将利伐沙班API粗品加入醋酸中，在一定温度下开始全溶解了，谁又能想到醋酸做重结晶的溶剂。一番操作下来，检测结果惊奇地发现母液中含有了杂质乙酰草酰胺、二胺和三胺。我仿佛明白了什么。

利伐沙班API粗品中含有的少量中间体2与醋酸在高温下不需要缩合剂就生成了乙酰草酰胺。之后随着工艺优化的推进，确定在洁净区前利伐沙班粗品用醋酸精制，二胺和三胺成了该步骤中的工艺杂质，含量约为0.01-0.03%之间。

到底二胺和三胺是何方神圣？经过分析，母液和粗品中这2个杂质含量都不高，母液还更加复杂。什么工艺耐受实验啊，各种条件的模拟啊，总之这两个杂质的量就是上不去。我多次送去做液质，想确定下杂质分子量，但都无功而返（不细说了）。时间等不及了，我选了一批300g左右的利伐沙班自制样品，里面只有二胺和三胺2种杂质，含量分别为0.03%和0.01%，开始重结晶。杂质多次富集后，竟然在TLC板子上看到两个相对明显的点。多次刮大板后，只得到了一个杂质，大概有不到1毫克，薄薄的贴在10ml反应瓶上。但当我欣喜的发现液相相对保留时间确定是二胺时，然而，质谱找不到明显的分子量，核磁也只能看出几个峰的突起，高场区域一塌糊涂……

Chapter 3

很多时候我们走的太快而忘记了是从哪里出发的。有多少人会把合成过程的中间体用相同的溶剂都做一套图谱便于用来比较，寻找杂质的蛛丝马迹？我只能一次次的送质谱寻求一点点慰藉，高场氢谱看不清就看低场嘛。到底能找到几个噻吩上的氢（每个噻吩环上有2个氢）？3个！那是到底是接上去了一个噻吩片段还是两个？大胆点说，2个！很好。可是结构上没有地方能再接一个噻吩片段了。还有哪里不同？吗啉部分有点不一样，看不清。那就认为是不一样。这么一想，反而一下子变得简单了，开环了！推断出了结构，杂质来源的机理就变得一清二楚了，酸性高温下吗啉环开环了，反应中剩余的微量噻吩酰氯和中间体2还有前一步带来的甲胺得到了2个工艺杂质。

图4：利伐沙班二胺和三胺杂质结构信息

图5：利伐沙班二胺HNMR

后面的故事就不用讲了，二胺解决了三胺还会远吗？到此为止利伐沙班片进口注册质量标准上的所有杂质全部定向合成完毕，我一个人既做工艺又做杂质，耗时不到3个月，同时工艺也得到了优化，杂质的来源去向得到了很好的解释，分析质量研究工作也顺利的开展，在那个年代可以说研发工作做到了问心无愧，当然也抢到了“前三家”。可又能怎样呢？

回首十年前，企业在药品开发中有关物质的研究手段及检测条件还相对落后，解释不清楚杂质的来源去向，也没有杂质标准品可以购买，一直是“工艺指导质量”的研发思路，但可喜的是一部分企业仍然能够按照“有中国特色的QBD的理念”将研发进行下去。

而十年后的今天，随着QCS这类杂质标准品公司的发展，对照品种类繁多，分析方法开发花样百出，药企在药品研发中也增加很多选择性和信息的对称性，让研发的速度得到提升，这是一件好事儿。但同时，药企在药品研发中仿佛又陷入到了另一个“怪圈”，跟几年前大家挖空心思研究和深挖杂质一样，最近这个基因毒杂质研究又开始如火如荼，正所谓你方唱罢我登场，基本套路都一样……

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